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滚蛋吧,污染君!
发布时间:2016-01-27        浏览次数:1299        返回列表

 图1-细胞污染 (1)

我叫CTLL-2,白细胞肿瘤君一枚,我爷爷的爷爷漂洋过海来到主人的实验室,传到现在的我已经记不得多少代了,爷爷曾经告诉我,祖上住在一个叫脾脏的地方,脾脏还住着远房亲戚-原代细胞,总之we are 伐木累。但是因为祖上就被人导入病毒增殖基因,变成带有癌变特征的永生化细胞株,我无论是形态结构还是功能都和原代细胞相去甚远了。好在颜值还算过得去,主人一直养着我玩。

污染君无处不在,主人有时候习惯又差,到处带着污染君让我们经历N种死法,真的很崩溃。来吧,看看主人是怎么做到的吧:

图2-细胞污染 (2)

1)血清没摇匀,分装不可行

图4-血清分装-new

有一次,主人打开-20℃冰箱拿出分装FBS的50ml离心管,惊讶的发现有些管颜色深有些浅,这是为什么呢?因为血清中含有丰富的蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等),当长期置于4℃冰箱时,这些蛋白可能聚集沉于瓶底而呈现深色(上清颜色浅),因此,记得要提醒主人哦,每次都要摇匀或均匀吹打上下层的血清再分装,这样才能让我们充分享受血清的养分呀。还有一次,主人分装血清,往50ml离心管非常实诚的加满50ml血清,血清结冰之后体积增大,果然第二天结冰的血清就撑爆了盖子,其实分装每管加45ml血清就可以了。那只爆裂的胎牛血清还能用吗?37℃解冻一下,0.2μm无菌膜过滤除菌还是可以用的。对了,还要提醒主人在实验室或细胞间常备一台便携抽滤泵,抽滤培养液省时省力。

2)胎牛无补体,加热不可取

主人觉得胎牛血清可能含有补体系统,对我不利,于是把血清56℃煮了30min,但是,加热会导致蛋白沉淀物形成,害得我的增殖速度还下降了。胎牛血清,顾名思义,就是屠宰怀孕母牛的时候通过心脏穿刺采血获取(非常血腥有木有,没有实验就没有杀戮),胎牛还在母牛体内,有胎盘屏障保护,补体等免疫蛋白分子是很难进入胎牛体内的,主人大可不必担心胎牛血清含有补体,血清可以放在37℃水浴锅解冻,时间不宜超过1h,解冻后尽快放回4℃冰箱待用,但是长期保存还是应该储存在-20℃冰箱。此外,相比胎牛血清,小牛血清通常会便宜些,养养屌丝级别的细胞株如Hela等还是可以,但是我和原代细胞这类比较高大上的还是选择Hyclone、Gibico、Cell Biologics品牌的胎牛血清吧。

3) 颜色分不清,我们很伤心

图片2

我在条件适宜的情况下,增殖速度还是很快滴,呼吸作用产生CO2,再加上培养箱中的锚点CO2溶解在培养液,PH下降的特别快,酚红慢慢的变成黄色,容易导致主人误以为我被污染了,甚至把我扔进垃圾桶!其实只要让我在室温下待一会,培养基又会恢复淡红色了。适宜我们细胞生长的PH在7.2-7.4左右,如果偏离此范围,我们的耐受能力要强些,但原代培养的细胞一般对PH变动耐受差。当我们细胞培养液颜色明显偏黄,或者细胞密度很大(悬浮细胞>108个/ml,贴壁细胞生长>70%)主人就应该换液或者传代了。总体而言,我们细胞耐酸性比耐碱性强一些,培养液用0.2μm过滤除菌后要注意,PH会上升0.1-0.2。

4)数量密度小,离心要减少

冻存液DMSO对我有毒性,复苏后需要及时离心除去。但是,我长时间冻存在液氮里,刚开始状态也不好,如果复苏后立即离心,会导致我的小伙伴们大批挂掉,得不偿失。主人正确的做法应该是先让我们复苏后休息下,隔天再置换新鲜培养基,去除DMSO即可。还有,主人拿我做流式胞内染色的时候,离心步骤很多,最后上机测荧光,Duang的一下就没了!因此,应当根据实际细胞密度适当减少离心次数。

5)污染要想无穷小,培养细节要记好

图3-细胞污染图

污染君无处不在,但是我们可以井水不犯河水。经过一段时间培养,我们状态好,尤其是处于指数生长期,就会对污染君产生营养竞争优势。但是,当我们细胞数量密度低的时候,污染君就容易爆发。污染君有不同类型,如果是细菌污染,培养基会出现浑浊,常见为明显或不明显的成串状,生长很快,培养基很快变得似泥沙状混浊,黑点移动速度非常快;如果是真菌感染,特别是初期污染,在低倍镜下可以看到小黑点,特别是成团的小黑点,要特别注意。如果无法确定,就换高倍镜,死细胞的话,高倍镜下就可以分辨,而真菌高倍镜下仍然是小黑点;另外,还有所谓的黑胶虫污染,高倍镜下可见黑色的条状物做非布朗运动,但是目前学界对胶虫君仍然有争议,这玩意究竟是不是生物还搞不清楚。

培养液、实验操作常常引入污染君,培养液的污染好排除,取同一批培养液和培养皿,不加细胞,置于细胞培养箱中培养24h或48h观察细胞液是否浑浊即可判断。

主人为了防污染君,也会往培养基加入双抗,我觉得双抗的效果很难说,不加双抗,我其实也长得挺好。

我每天都观察主人,总结以下细节要注意:

(1)穿戴不严谨,细胞易染菌:不穿鞋套不戴口罩不戴手套,做着实验还要骗骗隔壁的小师妹,殊不知开口闭口间污染君已经扩散。一套白大褂更是从年头穿到年尾没洗过,我要没被污染真是祖上冒青烟了。

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(2)拿瓶不拿盖,拿盖污染快:主人操作时要注意培养液不能溢出,保证滤器口和瓶盖干燥;如果有吸液泵的一定要小心废液,谨防倒流,否则污染了都不知道发生什么事。

(3)细胞间常洁净,污染君没法进:主人再懒也要给细胞间打扫下卫生,废弃培养基绝对不能丢弃在细胞间的垃圾桶,定期更换培养箱或水浴锅中的去离子水,必要时可以加入一定比例的苯扎溴铵。此外,细胞间超净台每天照照紫外,女生注意哦,照完紫外要通风10min把臭氧排掉,否则臭氧加速皮肤衰老。

我这么操心主人养细胞,可是最近主人开始又嫌弃我了,这也不能怪我啊,我们CTLL-2祖祖辈辈就是遗传有一段增殖停滞的过程,尤其是培养条件差了更不行,1640、FBS、双抗、IL-2一样都不能少,上次是主人自己从试剂代理商那里买的IL-2质量不行,害得我们死伤惨重。这次,他寻求Cell Biologics公司帮忙,引进一批脾脏原代内皮细胞、特定基因敲除的原代内皮细胞以及GFP转染细胞,据说,Cell Biologics 是全球领先的原代细胞供应商,可供应包括小鼠、大鼠、兔、犬、猕猴、人的,不同组织器官来源的原代细胞、肿瘤细胞、干细胞,简直就是欧巴什么都可以有啊,而且还提供相应细胞的完全培养基,养细胞so easy,老板再也不用担心我买错细胞因子了!主人呢,现在拿我已经做完了机制,打算继续拿Cell Biologics的脾脏内皮细胞验证毒性和深入研究分子机制,未来还可以用Cell Biologics提供的脾脏组织切片做做免疫组化,总之,主人是准备发CNS的节奏啊!

献上主人素颜照一张:

图片6

 

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