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浠思(上海)生物技术有限公司

药物发现、高通量药物筛选

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HTRF技术——加速您的天然药物活性成分筛选之脚步
发布时间:2015-10-08        浏览次数:939        返回列表

国庆长假期间,发生的最振奋民族自信心的事件,莫过于今年诺贝尔生理学或医学奖的一半奖金颁发给了中国科学家——屠呦呦。

 

屠教授及其同事在抗疟疾速效药物——青蒿素的发现、改进和发展方面做出的开创性工作,拯救了全球数以百万计的生命,为全球人类健康做出了重大贡献。

 

微信朋友圈瞬间再次被连续多天刷屏,各大订阅号微信争相转发报道。

 

然而青蒿素的发现历史,却是一个艰辛而漫长的过程。从1967年国务院成立5.23办公室,前后动用了数十个单位的500多名科研人员,用了5年的时间,筛选4万多种化合物和中草药,最后才发现了青蒿素

 

鉴于当时药物筛选技术和实验条件的落后,耗费如此巨大人力和漫长时间才筛选到有效成分——青蒿素,也实属不易。

 

时至今日,药物筛选技术早已层出不穷。上世纪90年代Cisbio公司开发的HTRF技术就是一种简单、迅速、灵敏的均相检测技术,专门用于药物研发前期的高通量筛选,既适合人工合成化合物库的筛选,又可用于天然药物活性成分的筛选。

 

HTRF技术结合了荧光共振能量转移(FRETFluorescence Resonance Energy Transfer 和时间分辨荧光 TRF, Time-Resolved Fluorescence))两大技术。利用稀土元素中镧系元素铕或铽的荧光半衰期较长的特性,将其作为能量供体标记在生物分子上,同时在另外一个生物分子上标记能量受体荧光素——XL665d2。当两个生物分子结合时,两个荧光素距离靠近,能量能够从供体转移到受体上,并使后者发光。因为铕或铽的半衰期与普通荧光素有6个数量级的差别。所以检测时,时间延迟100-150微秒,从而使普通背景荧光信号几乎为零,大大提高了检测灵敏度(图1)。

 

1 HTRF技术原理:FRET原理(左)和TRF原理(右)

  

以青蒿素为例,青蒿素抗疟疾的机制主要有三条:1. 自由基的抗疟作用;2. 对红内期疟原虫的直接杀灭作用;3. 抑制 PfATP6 酶的抗疟作用。

 

其中PfATP6 是恶性疟原虫基因组中唯一一类肌浆网/内质网钙 ATP 酶(sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPaseSERCA)。PfATP6酶能够消耗包浆内的Ca2+,同时水解ATPADP,并在类肌浆网/内质网内生成Ca2+。青蒿素抑制 PfATP6活性,使疟原虫胞浆内Ca2+浓度升高,引起细胞凋亡,从而发挥抗疟作用。

 

针对PfATP6ATP依赖特性,CisbioHTRF® Transcreener® ADP Kit基于生化实验,能够定量检测ADP生成的量,判断PfATP6酶的活性,进而筛选出PfATP6酶的抑制剂(图2)。

  

 2 HTRF Transcreener ADP Kit试剂盒原理

 

该试剂盒操作简单方便,加样、孵育后即可检测,中间无需洗涤,2个小时内可以结束实验,而且反应体系是20uL,最小可以做到4uL,非常适合高通量药物筛选。

 

HTRF技术除可用于酶抑制剂的筛选,还广泛用于如GPCR等其他领域的原研药筛选(图3),同时还可用于仿制药的筛选。

HTRF应用

3 HTRF技术应用领域

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