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肠道/土壤/水微生物16s rDNA测序/微生物多样性分析(最低价/最完整的16s分析结果)
发布时间:2015-05-24        浏览次数:4425        返回列表
宏基因组测序(metagenomics Sequencing)是对环境样品、肠道样品中的微生物群落的基因组进行高通量测序,主要研究微生物种群结构、基因功能活性、微生物之间的相互协作关系以及微生物与环境之间的关系。宏基因组测序研究摆脱了微生物分离纯培养的限制,扩展了微生物资源的利用空间,为环境微生物群落的研究提供了有效工具。
    我们采用Miseq 2*300测序策略,对16s rDNA双可变区V3、V4双可变区扩增测序,更准确鉴定微生物菌落组成和丰度。 

分析流程:

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基本概念:

16S rRNA及其测序区域B1434010961png_small
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OTU结果统计:

OTU数目和测序统计表

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SampleName:样本名称                         Coverage:是指各样品文库的覆盖率,其数值越高,则样本中序列没有被测
SampleSize:样本序列总数                     出的概率越低。该指数实际反映了本次测序结果是否代表样本的真实情况。
OTUsNumber:注释上的OTU数目                  计算公式为:C=1-n1/N  其中n1 = 只含有一条序列的OTU的数目;
OTUsSeq:注释上OTU的样本序列总数                          N = 抽样中出现的总的序列数目。                                                                 
表解读:该表主要是对每个样本的测序数量和OTU数目进行统计,并且在表格中列出了测序覆盖的完整度(显示前10个样本)

OTU分类水平统计表

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SampleName:样本名称                      Family:分类到科的OTU数量
Phylum:分类到门的OTU数量                 Genus:分类到属的OTU数量
Class:分类到纲的OTU数量                  Species:分类到种的OTU数量
Order:分类到目的OTU数量
表解读:该表主要是对每个样本在分类学水平上的数量进行统计,并且在表格中列出了在每个分类学水平上的物种数目(显示前10个样本)


 

OTU构成:

样本种属比例

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图中的每根柱子中的颜色表示该样本在不同级别(门、纲、目等)的序列数目,序列数目只计算级别最低的分类,例如在属中计算过了,则在科中则不重复计算。
图解读:横坐标中每一个条形图代表一个样本,纵坐标代表该分类层级的序列数目。同一种颜色代表相同的分类级别。

比例最高的前10个属构成柱状图

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图解读:横坐标中每一个条形图代表一个样本,纵坐标代表该分类单元的所占比例。同一种颜色代表相同的分类单元。


 

OTU构成及比较:

比例最高的前10个属构成气泡图

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图解读:横坐标中每一个列代表一个样本,纵坐标将比例最高的10个属从上到下以气泡形式排列,气泡大小代表该分类单元所占的比例。同一种颜色代表相同的分类单元。

OTU比较韦恩图(<=5个样本)

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图解读:每个圈代表一个样本,圈之间的重叠区域表示样本间共有的OTUs,每个区域的数字大小表示该区域对应的OTUs数目。如果样本超过5个则以分组信息进行绘图,分组超过5个则取前5个进行绘制


 

样品构成丰度:

稀释曲线

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图解读:横坐标代表随机抽取的序列数量;纵坐标代表观测到的OTU数量。样本曲线的延伸终点的横坐标位置为该样本的测序数量,如果曲线趋于平坦表明测序已趋于饱和,增加测序数据无法再找到更多的OTU;反之表明不饱和,增加数据量可以发现更多OTU。

Shannon-Winner曲线

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图解读:与上图一样,横坐标代表随机抽取的序列数量;纵坐标代表的是反映物种多样性的Shannon指数。样本曲线的延伸终点的横坐标位置为该样本的测序数量,如果曲线趋于平坦表明测序已趋于饱和,增加测序数据无法再找到更多的OTU;反之表明不饱和,增加数据量可以发现更多OTU。其中曲线的最高点也就是该样本的Shannon指数,指数越高表明样品的物种多样性越高。

 

样本多样性:

Rank-Abundance曲线丰度分布曲线

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图解读:横坐标代表物种排序的数量;纵坐标代表观测到的相对丰度。样本曲线的延伸终点的横坐标位置为该样本的物种数量,如果曲线越平滑下降表明样本的物种多样性越高,而曲线快速陡然下降表明样本中的优势菌群所占比例很高,多样性较低。

Alpha多样性(样本内多样性)

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表解读:Alpha多样性是指一个特定区域或者生态系统内的多样性,常用的度量指标有Chao、ACE、Shannon、Simpson等,Simpson指数值越大,说明群落多样性越高;Shannon指数越大,说明群落多样性越高。文件保存在结果目录中的alpha_div.txt。


 

Beta多样性分析(样品间差异分析):

PCoA分析

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图解读:图中每一个点代表一个样本,相同颜色的点来自同一个分组,两点之间距离越近表明两者的群落构成差异越小。

NMDS分析(非度量多维尺度分析)

QQ截图20150618161854
图解读:图中每一个点代表一个样本,相同颜色的点来自同一个分组,两点之间距离越近表明两者的群落构成差异越小。


 

Beta多样性分析及差异分析:

PCA分析

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图解读:图中每一个点代表一个样本,相同颜色的点来自同一个分组,两点之间距离越近表明两者的群落构成差异越小。

LDA差异贡献分析

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图解读:图中不同颜色代表不同样本或组之间的显著差异物种。使用LefSe软件分析获得,其中显著差异的logarithmic LDA score设为2。


 

物种进化树分布:

根据物种进化树的样本群落分布

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物种相关性分析:

物种相关性网络图A

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图解读:图中每一个点代表一个物种,存在相互关联的物种用连线相连,线的粗细和颜色的深浅都表示其相关性的高低。

物种相关性网络图B

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图解读:物种相关性的另一种表示图,图中每一个点代表一个物种,大小表示与其他物种的关联关系的多少,关联越多物种以及相关性越高则节点半径和字体越大,线的粗细表示物种之间的相关性大小,越大线越粗。
 


 

聚类分析:

无聚类热图
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图解读:热图中的每一个色块代表一个样品的一个属的丰度,样品横向排列,属纵向排列,此图没有进行聚类,样品排序按照分组直接显示。

聚类热图

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图解读:热图中的每一个色块代表一个样品的一个属的丰度,样品横向排列,属纵向排列,此图分别对样品和属进行聚类,从中可以了解样品之间的相似性以及属水平上的群落构成相似性。 


 

群落功能差异分析:

COG构成差异分析

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图解读:图中不同颜色代表不同的分组,列出了COG构成在组间存在显著差异的功能分类以及在各组的比例,此外右侧还给出了差异的比例和置信区间以及P-value。

KEGG代谢途径第三层分类差异分析

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图解读:图中不同颜色代表不同的分组,列出了在第三层级的构成在组间存在显著差异的KEGG代谢途径第三层分类以及在各组的比例,此外右侧还给出了差异的比例和置信区间以及P-value。

KEGG功能基因KO构成差异分析

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图解读:图中不同颜色代表不同的分组,列出了在组间/样本间存在显著差异的每一个功能基因(酶)以及在各组的比例,此外右侧还给出了差异的比例和置信区间以及P-value。 


 

环境因子分析:

RDA分析

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横轴和纵轴:RDA 和CCA 分析,模型不同,横纵坐标上的刻度为每个样品或者物种在与环境因子进行回归分析计算时产生的值,可以绘制于二维图形中。
图解读:冗余分析可以基于所有样品的OTU作图,也可以基于样品中优势物种作图;
箭头射线:箭头分别代表不同的环境因子;
夹角:环境因子之间的夹角为锐角时表示两个环境因子之间呈正相关关系,钝角时呈负相关关系。环境因子的射线越长,说明该影响因子的影响程度越大; 不同颜色的点表示不同组别的样品或者同一组别不同时期的样品,图中的拉丁文代表物种名称,可以将关注的优势物种也纳入图中; 环境因子数量要少于样本数量,同时在分析时,需要提供环境因子的数据,比如 pH值,测定的温度值等。
 



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结果目录说明:

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