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澳大利亚Monoquant公司开发数字PCR监测白血病

放大字体  缩小字体 发布日期:2013-12-13  浏览次数:15

  

Alec Morley博士是澳大利亚弗林德斯大学血液病学系的教授。他多年来一直从事白血病的研究。最初的工具是显微镜。当病人患上急性淋巴细胞白血病(ALL),有经验的病理学家会很轻松地找到许多白血病细胞。不过,Morley指出,一旦白血病细胞的比例降至1%以下,就无法用肉眼检测到。于是,Morley和他的同事开始寻找新的工具。最初,他们应用的是PCR,来检测ALL中的基因重排。定性检测是成功了,但能不能定量呢?为了回答这一问题,他们将细胞培养中的方法应用在PCR上。

无限稀释PCR

Morley曾经开发出一种技术来克隆淋巴细胞,以研究体细胞突变。将生长中的细胞分配在多个孔中,他发现突变克隆的生长遵循泊松分布。于是,他将这一原理应用在PCR上,将细胞替换成分子。这一过程,他们称之为“无限稀释PCR”,也就是数字PCR的前身。

然而,这是个相当艰苦的实验过程。据当时负责这项工作的Simhee Neoh介绍,他要进行许许多多次手工稀释,以找到一个正确的稀释点。一旦找到,他还要开展多个PCR反应,跑胶,并用宝丽来相机来拍摄每个结果。只有当大量凝胶跑完之后,他们才能汇集结果,开展泊松分析,并得到量化结果。污染也是个需要注意的问题,因为需要许多不同的样品,并开展巢式PCR反应。

尽管过程很艰苦,但他们的努力终于得到了回报。研究人员能够检测急性白血病的水平,这在治疗过程中经常发生变化。与显微镜相比,他们能检测更低水平的白血病细胞。具体来说,是0.01%,而不再是1%。

灵敏度的极大提高让他们打开了ALL的黑匣子。据Morley介绍,利用这种数字PCR过程,“我们能够根据微量残留病的水平,将患者分成三组:有些会治愈,有些会复发,及中间组。这种分类被许多更大型的研究所证实,成为治疗改良的基础。”

同时,研究小组也在许多期刊上发表了他们的成果。最让人激动的是,1994年在《柳叶刀》上发表文章,说明利用有限稀释PCR来高灵敏度地定量白血病细胞,可测定对治疗的响应,从而预测白血病的预后。

Morley及其同事也在《Biotechniques》上发表了他们的数字PCR研究,作为一种通用的定量方法。这篇文章被广泛引用,是数字PCR的早期重要文献之一。然而,即使他们获得了成功,但Morley等人还是逐渐远离它,开始转向实时定量PCR。“这是个好方法,但不实际,”Morley说。

微滴式数字PCR

如今,Morley还在继续努力寻找更好的方法来测定和监控白血病。他的公司,Monoquant,正在开发一种技术,利用患者的DNA来定量慢性粒细胞白血病(CML)。

为了简化这种DNA方法,Morley开始采用Bio-Rad的微滴式数字PCR(ddPCR)技术,来测定CML中特有的BCR-ABL易位。Morley认为:“微滴式数字PCR就像之前Simhee手工开展的工作。每个液滴包含一个PCR反应,读取为阳性或阴性的荧光。不再需要辛苦跑上25块凝胶,你可在几分钟内获得20,000个液滴,并快速读取。”

这种大规模的液滴带来了绝对定量目标序列所需的分辨率,而不需要标准曲线,这也是相对实时定量PCR的一个好处。“我们相信,微滴式数字PCR将让我们实现更精确的BCR-ABL易位的定量。”

尽管在DNA水平定量BCR-ABL实现了更灵敏的检测,但它也需要患者特异的方法。每个易位发生在基因组中一个独特的断裂点,但这些差异会在RNA转录过程中被剪接掉。为了获得足够的特异性,Morley创建了一个引物系统。“对不同的患者有不同的引物,而它们在效率上各不相同,”Morley解释道。“微滴式数字PCR很少受到扩增效率差异的影响。我们认为这会使监管机构更加看好我们。”

Morley也意识到实用性和精确性,因为他想要开发广泛应用的诊断检测。他认为;“在不同的仪器之间进行选择时,你需要真正了解具体的需求。我们称之为各有所长(horses for courses)。Bio-Rad的ddPCR技术带来了我们想要的,灵敏度水平满足我们的需求,而且它很快速。因此,这是显而易见的选择。”

“我选择血液学,是因为这是个东西能够量化的领域。你能回答问题,因为你能测定它们,”Morley谈道。“这是个了不起的事情。测定是个了不起的事情。”事实上,Morley的一生都在关注这种“大海捞针的问题”,找到并定量一种很小但很重要的标志物,从而帮助患病的人们。

Morley一直相信,如果他可以提出正确的问题,就能找到可测定的答案。从早期PCR技术的创新,到如今应用微滴式数字PCR技术,Alec Morley已经做到了这一点。

参考文献:

Brisco MJ et al. Outcome prediction in childhood acute lymphoblastic leukaemia by molecular quantification of residual disease at the end of induction. The Lancet 343, 196–200.

Sykes P et al. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. BioTechniques 13, 444–449.

 

 
 
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