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PCR Array 简单实用的检测基因表达的高通量方法

放大字体  缩小字体 发布日期:2014-04-25  浏览次数:126
公司介绍:上海启因生物科技有限公司

公司介绍:上海启因生物科技有限公司

启因生物是一家专业提供生命医学前沿研究技术及整体信息解决方案的高科技企业。致力于为生命医学领域的研究创新和成果转化提供技术及市场方案。

RT2 PCR引物和RT2 Real-TimeTM SYBR Green PCR反应体系

采用PCR芯片开展研究,技术上的难点是如何在同一次实验中,相同的PCR反应条件下保证不同的基因有相近的扩增效率,并且获得与单个基因实时定量PCR反应相当的灵敏度,特异性和可重复性。为此,SuperArray首先设计筛选出最佳的候选引物,接着通过实验,在不同反应条件下,检测PCR反应体系与几千条PCR引物的组合,最终获得了优化的引物和PCR反应体系,适应PCR芯片的要求。

RT2ProfilerTM PCR芯片引物的特点

通过计算机分析和实验验证,引物达到以下要求:
1
、特异性:通过BLAST等比对方法,检测确认引物在相应物种(人,小鼠或大鼠)全基因组中的高度特异性,有效避免非特异性产物产生。并通过实验证明引物不会扩增E.coli基因组,后者是Taq DNA多聚酶的常见污染源。
2
、均一性:所使用的引物的CG含量,解链温度(Tm),以及其他一些化学的和物理的特性都相似,以保证在相同的PCR条件(尤其是相同退火温度)下,芯片中的不同的基因都能扩增出特异性产物。
3
、扩增效率:引物扩增的片段大小均在100到200bp左右,确保在相同的反应时间内,不同的基因均能扩增出完整片段;并增强引物3’ 端的铆定能力,减少引物二聚体和非特异性退火的发生。

RT2ProfilerTM PCR芯片PCR反应体系的特点

在基于SYBR Green的实时定量PCR反应中,PCR反应体系也起到重要作用。严格控制的热启动Taq酶是一个关键因素。RT2 Real-TimeTM PCR反应体系采用了一种独特的,经过化学修饰的热启动Taq酶,只有在热激步骤之后,酶的活性才能完全发挥。在严格控制反应条件的情况下,在较低温度下发生的非特异性引物结合无法进一步扩增。其他的反应体系则常常将这些模板进一步扩增成为非特异性产物,造成假阳性结果。此外,Superarray还对RT2 Real-TimeTM PCR反应体系中的化学组分进行优化,进一步减少了引物二聚体的形成,并能保证最难扩增的片段都得到极高的扩增效率。PCR芯片结合了高质量的PCR引物设计和RT2 Real-TimeTM PCR反应体系,为PCR的高芯片质量提供了保证。
 
表格2总结了RT2ProfilerTM PCR芯片的特点。


研究者总是希望能检测到表达量相当低的基因,有时候,研究者得到的起始总RNA量也很少,但仍希望能进行实时定量PCR检测。为了满足研究者的这些需要,Superarray严格检测了PCR芯片系统的灵敏度。例如,Superarray使用PCR芯片检测了一系列总RNA样本,这些样本的浓度都不相同,使用的PCR芯片为炎症细胞因子和受体基因芯片,通常,这些基因的表达量都是很低的。图3将阳性信号的比例(Ct<35的基因所占百分比)与相应的总RNA量对应起来作图。结果表明,当起始的总RNA范围在5.0ng到1.0ug(甚至是5.0ug)时,每张PCR芯片的阳性信号比率均超过85%。对于表达量更高的基因,芯片检测的灵敏度还会大大提高,即在起始RNA量更低的情况下,芯片能够检测到的阳性信号比例更高。值得注意的是,起始的总RNA量最好不要低于0.5-1.0ug,否则会造成阳性信号损失。由于阳性信号比例在起始RNA量低时会显著下降,所以在实验中,检测的最低RNA量不少于5.0ng。

公司拥有国内唯一能够同时进行384孔最低反应体系1ul的高通量实时荧光定量PCR服务平台,并已优化和建立了基因定量检测引物数据库(已超过5000种基因),极大提高实验效率,降低实验成本。依托此平台,可以提供miRNA PCR芯片以及50多种细胞信号通路相关基因的PCR芯片等多种PCR芯片的技术服务。

 

公司相继自主开发了包括实验室记录管理系统,细胞冻存系统,质粒储存,试剂耗材订购和科研课题管理等实验室管理系统软件。专门提供生命医学领域所需软件系统的定制开发,实现信息化管理,提高管理效率。

 
 
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