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武汉百意欣生物——多肽的设计方案

放大字体  缩小字体 发布日期:2014-06-12  浏览次数:14
公司介绍:武汉百意欣生物技术有限公司

合 成多肽广泛运用于多肽结构/功能研究、抗体生产、多肽激素和激素类似物研究中。他们同样也被用于设计新型的酶、药物和疫苗。尽管在合成各种用途的多肽的时 候具有相当大的灵活性,但是氨基酸序列和长度能够影响合成、纯度和多肽的溶解性。因此,应该针对不同用途的多肽在设计方面需要更加地谨慎。

内容概况:

多肽设计的简介
多肽长度
多肽溶解性
多肽组成
多肽修饰

 

 

 

 

多肽设计的简介

根 据应用的需求不同,可以重新设计多肽,也可以根据天然蛋白来设计序列。合成的多肽可以通过修饰来改变它们的构造特征,加上纯化和检测、偶联上特定蛋白以制 造抗体、或者标记上同位素用于蛋白定量。多肽是复杂的生物分子,氨基酸构成直接导致了多肽具有独特的化学和物理特征。本文聚焦于多肽设计的关键之处,这些 设计将直接影响多肽的合成、纯化和稳定性,以及它们如何修饰。

 

多肽长度

多 肽长度是可变的,并且取决于它们用于何处。比如,10-20个氨基酸残基的多肽适用于抗体制备,然而用于结构/功能研究的多肽在长度方面更加灵活。尽管目 前在多肽合成策略方面的技术优势比以前更加有效,但是合成的粗肽纯度在很大程度上还是受目标多肽的长度影响甚多。随着多肽长度的增加,在每次的脱保护-偶 联循环中需要去除的杂质数量也将越来越多。此外,更长的多肽序列需要在增长的多肽和下一个氨基酸残基之间进行更多的偶联反应。在每一步偶联环节,单个多肽 分子上一小部分偶联反应的失败也将导致产生更多的不完整多肽片段。合成的完整全长多肽的含量与目标多肽的长度是成反比例的。因此,随着多肽长度的增加,并 且在从粗品混合物中纯化低丰度产品时增加了难度,产率也会因此削减。尽管75个氨基酸残基的多肽在合成方面没有问题,但这样的多肽在合成反应中的产率与合 成更短多肽的相比会低得多。

图示为多肽长度和目标多肽产率的关系。由于多肽合成的周期性特征,目标多肽的产率与其长度成反比例。

 

多肽溶解性

按照亲水性、疏水性、活性基团种类、在多肽序列中影响多肽合成稳定性或者在水溶液中的溶解最终产品的能力,可以把氨基酸分为以下几类:

氨基酸分类.

疏水性 (非极性)

Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Val

无电荷 (极性)

Asn, Cys, Gly, Gln, Pro, Ser, Thr, Tyr

酸性 (极性)

Asp, Glu

碱性 (极性)

His, Lys, Arg

含 有高比例亲水性氨基酸的多肽基本不会影响多肽在水溶液中的溶解性。在设计可溶性多肽时的一个经验法则是:每5个氨基酸残基中保证至少有一个是带电荷的。如 果不能达到这个要求,可以用带电荷的残基把序列中不影响多肽功能的氨基酸替代掉。当然,这也许会影响多肽的天然特征,因此需要周密考虑这种替代。

然而,没有经验测试的情况下是很难判定多肽确切的溶解性的,这里有一些一般的指导原则帮助您预测多肽的溶解性:

  • 少于5个残基的多肽一般在水溶液是可以溶解的,除非整个序列的氨基酸都是疏水的。
  • 带电荷氨基酸含量>25%的亲水性多肽和含<25%疏水性氨基酸的多肽往往在水溶液中可以溶解。
  • 疏水性氨基酸含量50%或以上的多肽将不溶解或只能部分溶解于水溶液。这些多肽首先需要溶解在有机溶剂(例如DMSO、DMF或乙腈)中后再用水溶液来稀释。
  • 多肽中高含量(>75%DEHKNQRSTY残基的,将会形成分子间的氢键(横向连接),并因此在水溶液中形成凝胶状。这些多肽应该要么需要溶解在有机溶剂中,要么需要调整缓冲液的PH值。
 

多肽组成

除 了多肽长度,某些氨基酸或氨基酸组合也能够对多肽合成、纯化、溶解性和稳定性产生负面影响。这些氨基酸可以被保守型氨基酸比如丙氨酸或甘氨酸替代,用类似 物删除或者取代。根据应用,多肽可能是基于天然蛋白设计,并且序列中经常包含在特定试验中对于功能必不可少的氨基酸,和在结构成分中非必需的氨基酸。对于 这种多肽,经验法则是尝试进行一些修饰或者替代掉非必须的氨基酸残基。对原始序列中处理困难氨基酸或者不需要组合的另一种方法是,要么轻微地移动序列以接 近原始序列来使得序列更加有利,要么就直接去除掉不利组合。

 

图示为移动多肽序列来避免不利氨基酸。除了用保守氨基酸替代那些可能干扰合成或纯化的无用序列以外,基于天然蛋白的序列有时能够被轻微的转移至排除的氨基酸(红色箭头指出)或去除的非必需序列。

下面是在设计重新或原始多肽的几点指导,这些多肽都含有对合成、纯化、保存和溶解性有利的组成。

半胱氨酸甲硫氨酸是 易快速氧化的,这在合成和随后的纯化中会导致保护基团的裂解。为了避免此种情况,可以用丝氨酸代替半胱氨酸或者用正亮氨酸(Nle)代替甲硫氨酸。一条肽 中含有多个半胱氨酸会容易形成二硫键连接,但在缓冲液中加入还原试剂比如二硫苏糖醇(DTT)或者用丝氨酸代替Cys可以有效避免这种成环。多肽中的半胱 氨酸残基经常用于抗体制备中以影响抗体的亲和性,因为游离的Cys在体内是不常见的,因此天然多肽结构可能无法识别它。

N端谷氨酸是不稳定的,因为它在脱保护时的酸性环境下会形成环状的焦谷氨酸。但这可以通过进行N端乙酰化或者用已有的焦谷氨酸(或保守氨基酸)替代来避免。

N端天冬酰胺也该避免,因为天冬氨酸的N端保护基团在多肽去保护时是很难被去除掉的。因此,要么直接去除它要么代替掉N端氨基酸。

天冬氨酸容易水解并在不存在甘氨酸、脯氨酸或丝氨酸时造成多肽在酸性环境下裂解。替代或者移动序列可以避免这些结合。

多丝氨酸或多脯氨酸残基存在于序列中能够导致合成中的重大缺失,尤其是脯氨酸残基,它能形成顺/反异构并降低多肽纯度。

一连串的谷氨酸、异亮氨、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、酪氨酸或缬氨酸能够形成β折叠,β折叠可在多肽合成中形成不完整融合效应而导致序列缺失。天冬酰胺的保守替代谷氨酸或者丝氨酸替代苏氨酸、每三个氨基酸加入脯氨酸或甘氨酸、移动序列等方法都可以打破β折叠。

 

多肽修饰

合成多肽中一个强大的方面是能够按照需求意愿对多肽进行修饰改造,常规和特殊氨基酸组成的多肽都含有活性基团可以用来进行修饰,这些基团包括:

  • N端氨基-NH2
  • C端羧基-COOH
  • 赖氨酸的ε-氨基
  • 丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的侧链羟基-OH
  • 精氨酸的侧链胍基
  • 半胱氨酸侧链巯基-SH

常见的多肽容易修饰部位. 多肽中的氨基酸有特定活性部位可以修饰, (A) N端氨基; (B) 赖氨酸的ε-氨基; (C) 半胱氨酸侧链巯基; (D) 丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的侧链羟基; (E) 精氨酸的侧链胍基; (F) C端羧基.

修 饰种类繁多,总的修饰量也非常多。它们之中的很大一部分是在体内的翻译后修饰过程中就形成,然而其他的一些天然氨基酸的替代品(含有非天然基团或同位素标 记等)并非在此过程形成。此外,通过化学交联可以把标签或蛋白等添加到前面提到的活性基团部位。由于多肽合成时是从C端到N端的,所以任何的标签和荧光标 记都可以交联到N端。

但是,下面列出的修饰有的基团已经修饰过,这部分就没办法彻底交联了。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

磷酸化

磷酸化丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸能够定位在多肽的任何位置。尽管多磷酸化氨基酸能够修饰进来,但对于多肽的合成和纯化都造成负面的影响。

乙酰化/酰胺化

化学合成多肽含有正或负电荷的氨基或羧基,因为这些末端在体内是中性的,所以往往合成的多肽需要在N端进行乙酰化和C端进行酰胺化,以模拟多肽在体内的中性状态。

甲基化

组蛋白甲基化在表观遗传学中是普遍的现象,赖氨酸侧链的单甲基化、双甲基化和三甲基化可以模拟翻译后修饰。半胱氨酸的巯基也可以通过乙酰氨基甲基(Acm)保护进行选择性地形成二硫键。

旋光体/对映异构体

标准的多肽由L型氨基酸构成,但是在合成时也通常采用D型氨基酸替代,但化学分子式是一样的,D型氨基酸有可能模拟了多肽的某些功能。

同位素标记

与标准氨基酸相比,同位素标记是指用13C a或 15N 代替原有的12C and 14N原子。 重标氨基酸是非放射性的,只是分子量比标准氨基酸大一些。这种分子量的区别能够让其在蛋白定量分析和、蛋白结构分析和MS(或NMR)鉴定中成为有力的工具。

环化

环化能够模拟天然的多肽结构或者合成稳定的多肽类似物,可以增加多肽的稳定性。环肽也可以防止多肽水解和降解。两种最常用的环化方法如下:

  • 酰胺环化
  • 巯基环化 (形成二硫键)

连接臂

连接臂能够把多肽和标记分开一段距离来。这些化学结构能够把把多肽与tag和标记分隔开,不同长度的连接臂经常在可变长度与标记中能够见到。常见的疏水性连接臂有6-氨基己酸(Ahx),常见的亲水性链接臂有聚乙二醇(PEG)。

标签

标签与多肽偶联在试验中通常可以帮助纯化和检测。根据标签的种类,它们也可以用来帮助多肽定位于特定的细胞区室(例如细胞膜、细胞质)。在多肽合成中,常用的标签有生物素( Biotin )、脂类物质(例如farnesyl, formyl, myristoyl, palmitoyl 和 stearyl groups)

 

 

染料

染料常用来帮助定位和蛋白结合研究,通常分为荧光染料、淬灭剂(无荧光,用于淬灭靠近的荧光分子)和色原体。下表是一些常见的染料:

在多肽修饰中常见的染料

荧光染料

7-Amino-4-methyl-coumarin (AMC)

UV-excitable dye used in enzyme assays using cuvettes or by
flow cytometry

5-((2-Aminoethyl)amino)napthalene-1-sulfonic acid
(EDANS)

A commonly used dye in fluorescence resonane energy transfer 
(FRET) peptides in combination with Dabcyl as a quencher

Fluorescein derivatives (FITC, FAM)

A commonly used fluorescent dye in confocal laser-scanning 
microscopy and flow cytometric applications

7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole (NBD)

A fluorescent dye used for amine modification

Rhodamine derivatives (Rhodamine B, TAMRA)

A commonly used group of fluorescent dyes used in many
fluorescent applications

荧光淬灭

Dabcyl

A non-fluorescent dye prodominantly used as a quencher for 
other fluorophores, especially fluorescein derivatives or EDANS

Dansyl

A fluorophore quencher that, unlike Dabcyl, has a specific 
wavelength emission

2,4-Dinitrophenol (DNP)

A non-fluorescent dye that can be used as a quencher similar to 
Dabcyl

其余

p-Nitroaniline

A chromogen used as a colorimetric enzyme substrate in many
standard enzyme assays

免疫原

多肽-蛋白偶联体经常用来制备针对多肽的抗体。单独的多肽分子量太小,以至于不足以刺激细胞产生相应的抗体。因此,目标多肽经常需要偶联上蛋白进行制备抗体。其中一个关键因素是免疫系统把多肽-蛋白偶联体当作是一个整体来反应,因而在纯化阶段需要把那部分针对单独蛋白产生的无效抗体去除掉。制备抗体中常见的载体蛋白有以下几类:

  • 钥孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin,KLH)– 在节肢动物和软体动物中发现的一种含铜的非血红素蛋白,其分子量为4.5 x 105至 1.3 x 107 Da。KLH由于其高免疫活性成为最常用的一种载体蛋白。
  • 牛血清白蛋白(Bovine serum albumin ,BSA) – 一种在牛体内稳定的可溶蛋白,其分子量为67 x 103 Da ,含有59个赖氨酸残基,其中的30-35个适用于偶联。这种特征使得BSA在弱抗原性复合物中成为一使用广泛的载体蛋白。
  • 卵清蛋白(Ovalbumin,OVA) – 从鸡蛋中分离出的一种蛋白,其分子量为45 x 103 ,想要知道抗体是否针对单独多肽或者非偶联蛋白(例如KLH、BSA)的话,用OVA去鉴别是一种很好的选择。
  • 复合抗原多肽(Multiple antigen peptides MAPs – 是一种分支多肽,通过Lys骨架连接,能够用于制备抗体(没有使用大蛋白去刺激细胞也能产生抗体)。根据合成需要,MAPs通常有4分支、8分支和12分支。

 

非天然氨基酸

20种天然氨基酸(即基因编码氨基酸)相比,非天然氨基酸不是由通用的遗传密码编码产生,然而,它们经常在自然界中作为新陈代谢产物被发现,尤其是植物和细菌。以下是一些例子:

  • 胍氨酸(Citrulline)
  • 鸟氨酸(Ornithine)
  • ε-乙酰-赖氨酸
  • β-丙氨酸
  • 氨基苯甲酸
  • 6-氨基己酸 (Aca; 6-Aminohexanoic acid)
  • 氨基丁酸 (Abu)
  • 羟基脯氨酸
  • 巯基丙酸 (MPA)
  • 3-硝基-酪氨酸
  • 正亮氨酸(Nle)
  • 焦谷氨酸(pGlu)

 
 
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