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促销时间:2014-06-05至2014-06-30        浏览次数:52        

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STZ造模小知识第三版》
                                  --------------------李景风
STZ 诱发糖尿病动物模型的原理
         STZ对一定种属动物的胰岛β细胞有选择性破坏作用,能诱发许多动物产生糖尿病,一般采用大鼠和小鼠制造动物模型。国外有学者报道选用雄性大鼠制造模型的成模率明显高于雌性大鼠。1型糖尿病与2型糖尿病动物模型的制备与STZ注射的剂量有关系:大剂量注射时,由于直接引起胰岛β细胞的广泛破坏,可造成1型糖尿病模型;而注射较少量STZ时,由于只是破坏一部分胰岛β细胞的功能,造成外周组织对胰岛素不敏感,同时给予高热量饲料喂养,两者结合便诱导出病理、生理改变都接近于人类2型糖尿病的动物模型。
 
造膜前的喂养
Ⅰ型糖尿病模型成模比较快,通常在普通饲料适应性喂养2周后即可开始造模
Ⅱ型糖尿病模型:高脂饮食诱导加相对小剂量STZ。造模前喂以高脂(高糖)饲料,诱发出胰岛素抵抗。
 
高脂(高糖)饲料
《高脂(高糖)饲料配方》
    高脂(高糖)饲料配方的相关文献版本众多,或许和成模标准一样,没有黄金标准,其中被引用较多的一组数据是含10%蔗糖,10%猪油,5%胆固醇;
   如果我们自己调制,可以尝试由基础(鼠)饲料加蔗糖、炼猪油和蛋黄按比搭配制作,其比例为:猪油18 % ,蔗糖20 % ,蛋黄3 %,基础饲料59%。因为基础饲料、猪油和蛋黄等原料含量不清,因此依照上述比例配置的高脂(高糖)饲料,其含量比例也不是十分绝对的,(另外胆固醇价格较高,如果有条件可以加纯度高的胆固醇),按照这个比例配置是否得到前面的文献比例,这个我们并未做含量检测,但喂养后的效果我们觉得还是可以的;同时,可以根据动物的口感,做略微调整,比如,增加猪油或全脂奶粉等,让动物更爱吃。(注:我们只通过此法配置过大鼠高脂高糖饲料)     
预实验的重要性
很重要。实验时STZ的给药量应参照预实验的结果,尽量不要盲目按照文献上或他人的给药量来直接使用,鼠均重和空腹(低糖状态)抗药力、禁食时长、注射选时、以及之前饲养过程、测糖选时等都不相同,通过预实验来确定符合自己实验鼠的给药计量,才是最科学的。
 
常用给药剂量
动物的均重(注射时)不同,预实验剂量选取也不同。STZ单位剂量选取上体重成反比关系。
举例(例为鼠/腹腔/一次给药):
220-250克大鼠重为例  Ⅰ型糖尿病模型:剂量通常为65~50mg/Kg;
Ⅱ型糖尿病模型:高糖高脂喂养四-八周,STZ 剂量通常在35~50mg/Kg;
180-200克大鼠重为例  Ⅰ型糖尿病模型:剂量通常为70~50mg/Kg;
Ⅱ型糖尿病模型:高糖高脂喂养四-八周,STZ 剂量通常在55~40mg/Kg;
25-35克小鼠  Ⅰ型糖尿病模型:剂量为150-200mg/Kg;(多采用分次注射,例如50mg/KgX4次)
Ⅱ型糖尿病模型:高糖高脂喂养四-八周,STZ 剂量在65-100mg/Kg;
剂量的选取,直接决定成模的效果,本人仅给出一些参考范围,具体剂量的选取,希望大家通过预实验的结果来最终确定。以上数据仅能得出不同重量动物在STZ单位给药量上的关系,即体重越大的动物,单位剂量要适当减少;当然体重大的动物总的STZ耗量仍是高于体重小的。
 
单次注射和多次注射之间的关系
举例:每次给药50mg/Kg,连续给三次,总剂量为150mg/Kg的方法与一次给药150mg/Kg方法相比,前者死亡率可能得到缓解,但STZ的对胰岛β细胞的破坏力不如后者(一次给药)来得明显彻底。换句话说,多次注射,可能减少死亡,但一次注射效果明显,如果剂量选取科学,一次注射可以直接到位。建议根据动物品种和抵抗能力,来决定给药次数,目前,大部分用户采用一次注射方法。
 
分次注射的周期和次数的选取
周期:STZ注射后,药力发挥主要集中在注射后的3-72小时,特别是在前24小时。所以如果采用分次注射,希望在2-72小时内延续第二次注射,目前大部分使用者以24小时为周期居多。
次数::从1~7次都用人选用过。根据使用这情况大致排序:1次3次  2次  5次  7次
配置STZ
柠檬酸缓冲液的配制:
柠檬酸(FW:210.14)2.1g加入双蒸水100mL中配成A液
柠檬酸钠(FW:294.10)2.94g加入双蒸水100mL中配成B液
链脲佐菌素配制液:用时将A、B液按一定比例混合(1:1.32也有按1:1的),PH计测定ph值,调节ph=4.2-4.5,即是所需配置STZ的柠檬酸缓冲液。
 
常见问题
如果我缓冲液配完后PH值不在范围内怎么办?
加溶剂(溶剂皆为偏酸)或加水调节即可。
 
我的缓冲液可否贮藏再用?
可以。用的时候再次测PH值,保证合乎范围。
 
缓冲液是否需要过滤和灭菌?
必须过滤。柠檬酸/柠檬酸钠为普通的化学试剂,内有杂质影响动物对STZ的吸收。特别是直接静脉注射,严格要求过滤。
关于灭菌,目前没有发现是否灭菌对实验的影响,我们主张是,如果条件允许,采用静脉注射的使用者最好灭菌,而腹腔注射的用户可以不做灭菌处理。
注射时用柠檬酸缓冲液以1%的浓度溶解STZ,按空腹体重注射相应的STZ,  在30分钟内注射完毕。★STZ容易潮解失活, STZ快速称取后仍严格要求干燥,推荐用干燥铝箔(或锡箔)纸或干燥的称量纸。
 
能否使用其他溶液配置缓冲液
可以。但我们推荐使用柠檬酸。例如用醋酸等溶液,也可以做出,但其PH值不好控制,而STZ只有在PH4.2-4.5的时候才具有最佳药力活性。
 
禁食和血糖的联系
禁食12小时以上(一般过夜禁食,不禁水)。禁食的时间越长,STZ对胰岛β细胞的破坏力越明显,即药效越高。所以相对禁食时间延长,可以降低STZ的用量。
腹腔注射和尾部注射的区别
尾部注射即静脉注射,药物利用率较高,同比腹腔注射,可节省药量,缺点是操作起来不如腹腔注射方便。
 
注射前有那些操作步骤?
过夜禁食后称重,按大鼠总重量比称取STZ,放一干燥灭菌瓶内,外用锡纸包好,将柠檬酸缓冲液及装STZ的瓶子置冰浴(此时未溶解STZ!),一起带到动物房,如果注射操作技术不熟练,应两组交替注射,建议分组溶解STZ,比如10只或15只鼠/组。确保STZ在溶解后,30分钟内用完(且越快越好)!
 
注射时,推进速度和血糖的关系
推注的速度快,更容易形成高血糖,推注的速度慢,相对的危险性较低,但也不容易成模,常规操作中多要求快速注射。当然,STZ的剂量是决定血糖高低的主要因素。
 
成模后饲养问题
     调查得出,那些注射剂量准确或者偏高于理想剂量的(部分死亡),成模后往往能较长时间维持高糖;而那些大部分勉强达标,即部分“成模”,此时有血糖回落的可能.建议这种情况下,如果想长时间维持高糖状态,建议继续给高脂喂。
 
死鼠问题的解决
鼠的个体差别和空腹(低血糖)抵抗力的差异而致死亡率的不同,开始死亡率高可能主要是血糖突然升高,鼠不适应,或发生了DKA(即酮症酸中毒)。
首先,一定要保证足够的饮水量(饮水量不足容易导致死鼠);
其次,高血糖和低血糖都会造成死鼠,避免死鼠可以通过注射胰岛素或暂时补糖,两种途径:1、常见为血糖过高。补胰岛素法,补一些中效胰岛素。例如给诺和灵n或NPH(中性鱼精蛋白锌胰岛素),每次2--3个单位,过了3-5天,大鼠一般死亡率就低了;2、补糖法,禁食后的鼠,注射的时候已经处于低血糖状态,造模4小时后腹腔注射百分之20的葡萄糖,可避免因注射时血糖过低死鼠;
再次,防止动物自相残杀。食物缺乏和供水不足的情况下,会互相撕杀、啃食同类,所以食物和饮水要供应充足,最好是两路供应;
最后,防止感染。糖尿病大鼠尿量多,垫料潮湿,需要勤换垫料,所以糖尿病大鼠较其他大鼠容易出现感染,特别是泌尿道感染和腹腔感染。腹腔注射、皮下注射及采血测血糖等侵入性操作前后,要注意消毒工作。如每次采血测血糖后可用四环素(或金霉素眼药膏)局部涂抹处理伤口预防感染。
模型不达标者,三天后补注STZ(以25mg-40mg/kg体重剂量腹腔注射),也很容易成模,或让血糖恢复正常后再常规剂量注射;但要达到理想的效果,往往是恢复到正常状态下重新造模。
 
STZ的保存方法
2-8℃,干燥避光保存。(注:本品易潮解,如需反复取量过程中,应避免其触水受潮,受潮后30分钟后失效,这和注射时要求其快速注射是一个道理,即其水溶液不稳定)。
 
多次称取STZ时的操作方法和注意事项
如确实需要多次称取,要严格按照避免受潮的原则操作和存放。
操作方法:操作环境、盛装容器、分装工具都必须保证干燥。无需冰浴,分装后用封口膜密封瓶口,用铝箔纸(或锡箔,即避光)将瓶子包好,装入防潮塑料贴袋中(双层更可取),并2-8℃冷藏,可长期保存。本品保质期为3年半。再次使用时,开启瓶口前应先使瓶口通风干却。


 
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