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酵母质粒DNA小量提取试剂盒

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品牌: 东盛
型号: N1061/N1062/N1063
规格: 50次/100次/200次
单价: 345.00元/盒
起订: 1 盒
供货总量: 99 盒
发货期限: 自买家付款之日起 3 天内发货
所在地: 广东 广州市
有效期至: 长期有效
浏览次数: 3
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公司基本资料信息
 
 
产品详细说明

 酵母质粒DNA小量提取试剂盒

 

 

货号

规格

价格

N1061

50次

345

N1062

100次

575

N1063

200次

1100

 

 

产品组分

 

组分

货号

N1061

N1062

N1063

RNaseA(10 mg/ml)

150 μl

300 μl

600 μl

溶液YⅠ

15 ml

30 ml

60 ml

溶液YⅡ

15 ml

30 ml

60 ml

溶液YⅢ

20 ml

40 ml

80 ml

溶液PB

30ml

60ml

120 ml

溶液W

30 ml

30 ml×2

40 ml×3

溶液Eluent

5 ml

10 ml

20 ml

DNA纯化柱

 50个

 100个

 200个

说明书

1份

1份

1份

 

注:溶液W初次使用前用无水乙醇按1: 1.5稀释,即含60%乙醇。

        溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、溶液PB中含有碱和变性剂,请不要与皮肤直接接触。

       上述产品组分均可单独购买,详见产品索引。

 

保存条件

RNase A:-20℃保存。RNase A为浑浊溶液。初次使用本试剂盒时,请将RNase A全部加入到溶液Ⅰ中,均匀混合后于4℃保存。可保存6个月。

其他试剂:室温保存。

若溶液YⅡ出现沉淀,请于37℃保温溶解,待恢复至室温后使用。沉淀的出现不会影响质粒DNA的纯化结果。

 

产品说明

本产品采用了经典的硅胶膜及碱裂法技术,用于酵母质粒DNA小量纯化。纯化原理是用溶壁酶消化酵母细胞的细胞壁,碱裂解酵母细胞后,硅胶膜柱高效可逆地

吸附体系中的质粒DNA(高盐、低pH值),蛋白及其它杂质不被吸附而被除去,被吸附的DNA在低盐、高pH值条件下再被洗脱纯化。一次可从1-5 ml(不超过

5×107个)的过夜培养的酵母菌液中纯化高纯度质粒DNA(OD260/280 = 1.7-1.9),此质粒DNA可直接用于DNA序列分析以及各种酶促反应等。

 

注意事项

1  溶壁酶需要客户另行购买(东盛货号:N9032、N9031)。

2  通常酵母质粒拷贝数都很低,一般通过电泳或者分光光度计法都很难检测到。提取的质粒DNA如用于下列实验,通常建议使用量为:

   用作PCR 模板:1–5μl质粒DNA。

   转化大肠杆菌:5–10μl 质粒DNA。

3  所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心,速度为12,000 rpm(约13,400×g)。

4 所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心,速度为12,000 rpm(约13,400×g)。

5 溶液 Eluent(10 mM Tris-HCl, pH 8.5)中不含EDTA,其收集的DNA片段可直接用于各种酶促反应等,不会影响后续试验。

 

产品特点

高纯度:OD260/280= 1.8-2.0。无须经酚/氯仿抽提,可直接使用。

 

产品用途

PCR扩增

转化

 

质量控制

从酵母提取pBI121质粒DNA。提取的质粒DNA质量通过琼脂糖凝胶电泳、限制性酶切和序列测定分析。

 

酵母质粒DNA提取流程图

图1  酵母质粒DNA纯化流程图

 

 

操作方法

1  取酵母细胞液1-5 ml(最多不超过5×107个)。12,000离心1min,尽量去除上清。

2  向菌体中加入300 μl 山梨醇缓冲液和50 U溶壁酶,漩涡振荡直至菌体完全悬浮。在摇床上220 rpm/min,30℃处理1 小时。

   注:根据酵母菌株和数量的不同,所用溶壁酶用量和孵育时间应该进行适当调整。

3  5,000 rpm离心10min,去上清,收集沉淀。

4  加入250 µl溶液YⅠ/RNase A混合液,漩涡剧烈振荡直至菌体完全悬浮。室温静置1-2min。

    注:初次使用本试剂盒时,请将RNase A全部加入到溶液Ⅰ中,均匀混合后于4℃保存。可保存6个月。

            不要残留细小菌块。菌液重新悬浮充分与否将决定质粒DNA的得率。

            室温静置1-2min是为使溶液中的RNA被充分降解。

5  加入250 µl溶液YⅡ,立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次。室温放置1-2min,使菌体充分裂解,直至形成澄清的裂解溶液。

   注:若溶液Ⅱ出现沉淀,请于37℃保温溶解,待恢复至室温后使用。沉淀的出现不会影响质粒DNA的纯化结果。

           加入溶液Ⅱ后,不可剧烈混和,否则会使染色体DNA断裂。此时菌液应变得清亮粘稠,如果未变得清亮,可能由于菌体过多,裂解不彻底,应减少菌体量。

6  加入350 µl溶液YⅢ,立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次。此时会出现白色絮状沉淀。

   注:加入溶液Ⅲ后,应立即混匀避免产生局部沉淀。

7  12,000 rpm室温离心10min,收集上清。

8  将上清置于DNA纯化柱中,静置1-2min。

   注:如果收集的上清液过多,超过DNA纯化柱容积(15 ml),可将上清分次加入DNA纯化柱中

9  12,000 rpm 离心1min,弃滤液。

    注:此时质粒DNA被吸附于DNA纯化柱中的硅胶膜上。

10  加入500 µl 溶液PB。12,000 rpm 离心1min,弃滤液。

    注:此步骤的作用是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱,以获得高质量质粒DNA。

11  加入500 µl溶液W。12,000 rpm 离心1min,弃滤液。

   注:溶液W初次使用前用无水乙醇按1: 1.5稀释,即含60%乙醇。

12 加入500 µl溶液W。12,000 rpm 离心1min,弃滤液。

13 12,000 rpm离心3min,以去除纯化柱中残留的液体。

   注:此步骤的作用是去除残余酒精,避免降低质粒的生物学活性,影像下游酶促反应。

14 将 DNA 纯化柱置于新的1.5 ml离心管中。向纯化柱中央处,滴加50-100 µl溶液Eluent,室温放置2min。12,000 rpm离心1min,管底即为高纯度酵母质粒

DNA。酵母质粒DNA置于-20℃保存。

   注:溶液Eluent可用无菌双蒸水代替,但其pH需为8.0-8.5,加入体积视质粒拷贝数多少、用户对质粒浓度要求而定。对溶液Eluent 60℃预热,会提高提取酵母质粒DNA的产

量。

 

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