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中洪博元生物 RT-PCR

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品牌: 中洪博元生物
型号: 0013
规格: 1
单价: 面议
发货期限: 自买家付款之日起 3 天内发货
所在地: 广东 深圳市
有效期至: 长期有效
浏览次数: 1
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公司基本资料信息
 
 
产品详细说明

 简介: 即聚合酶链式反应是一种分子生物学技术

提供商: 中洪博元

服务名称: PCR

地区: 深圳

支付说明:

实验周期:2周内

中洪博元强大的科研团队提供实验外包服务,科研人员 80%以上是硕博以上学历。

以下所列服务提供的报价均针对单个样品,促销价格在活动期间有效。

实验外包所需的实验周期是指确认样品到完成,不包括邮寄时间。

会有专门的技术人员指导你如何提交样品,针对你的贵重样品会签订相关协议,保护你的样品。

实验中相关的试剂,一般试剂均可提供,特殊试剂用户可以自行提供或由中洪博元代为有偿提供。

实验结束后,中洪博元提供实验原始数据和实验记录。

可签订保密协议,保障实验数据安全有效。

根据用户实际需求提供发票,签订协议后支付一半的款项,即可开全款发票,然后再补足尾款。

通过在丁香通平台上支付少量订金,享受丁香通带给你的双重保障,当出现问题,丁香通会全力保障你的权益。

 

产品简介: 

简介:聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,简称PCR)又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。

原理:PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成

 

RT-PCR:

(1)概述:由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”,由依赖RNA的DNA聚合酶(逆转录酶)来完成。随后,DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成,随每个循环倍增,即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解,留下互补DNA。

(2)RT-PCR技术相关试剂:

RNA提取试剂盒

oligo:多聚体,相当于mRNA引物

AMV RT:禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶

MMLV RT:莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶

dNTPs:脱氧核苷酸

RNase:RNA水解酶

MgCl2:2价镁离子

 

操作步骤:

①总 RNA 提取:

材料处理:

(1)植物组织:取新鲜植物组织在液氮中充分研磨或将植物组织剪碎后直接在

TRIzon 中迅速研磨,每 30-50mg 组织加入 1mlTRIzon,混匀。

动物组织:取新鲜或-70℃冻存的动物组织尽量剪碎,每 30-50mg 组织中加 入 1mlTRIzon,匀浆仪进行匀浆处理。或在液氮中研磨后加入 TRIzon 1m 混匀。

单层培养细胞:吸去培养液,加入适量 TRIzon(每 10cm2 需要 1mlTRIzon), 反复吹打使细胞裂解。如果 TRIzon 的量不足可能导致 RNA 中有 DNA 污染。

(4)细胞悬液:离心收集细胞。每 5×106-1×107 动物、植物和酵母细胞或每 107细菌细胞加入 1mlTRIzon。

②逆转录:

试剂 20ul 反应体系 终浓度

 dNTP Mix,2.5mM Each 4ul 500uM Each

Primer Mix 2ul  

RNA Template xul 50pg-5ug

RNase-Free Water up to 13ul  

3、70℃孵育 10min,迅速冰浴 2min。  

4、短暂离心,使管壁上的溶液收集到管底。  

5、继续向以上反应液中加入以下试剂:  

试剂 20ul 反应体系 终浓度

5×RT Bufer 4ul 1×

DTT,0.1M 2ul 10mM

HiFiscript(200U/ul) 1ul  

6、50℃孵育15min,85℃孵育5min。短暂离心,-20℃保存。

③PCR:

操作体系

配制成25ulPCR反应体系如下:

      RNase Free dH20              9.5ul

      cDNA                          1ul

     上游引物                       1ul

     下游引物                       1ul

     2xGoldStar Taq MasterMix      12.5ul

PCR扩增条件:(设置梯度退火温度查找)

    步骤       温度        时间

   预变性       95℃       5min

     变性       95℃       45s

     退火     引物而定     45s

     延伸       72℃       45s

               30-40个循环反应

     终延伸     72℃       10min

④电泳:

凝胶准备→胶床准备→铺胶→静置→拔梳子→胶床置于电泳槽中

 

→ 加电泳缓冲液→上样→电泳→取出凝胶→拍照

 

2、荧光定量PCR:

(1)概述:荧光定量PCR( realtime fluorescence quantitative PCR,RTFQ PCR) 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术,它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。

(2)QPCR技术相关试剂:

RNA提取试剂盒

oligo:多聚体,相当于mRNA引物

AMV RT:禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶

MMLV RT:莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶

dNTPs:脱氧核苷酸

RNase:RNA水解酶

MgCl2:2价镁离子

荧光染料或TaqMAN探针

操作步骤:

①RNA 提取:同RT-PCR;

  基因组DNA提取:

材料处理:

一、动物组织:取25mg(脾组织用量少于10mg);如果材料为鼠尾,取一段长度为0.4-0.6cm的大鼠鼠尾或两段0。4-0.6cm的小鼠鼠尾。

样本进行液氮研磨或切成小块后置于1.5ml离心管中,加入180ulBuffer GTL,将不同样品做好标记。

使用匀浆器处理,匀浆前加入不超过80ulBuffer GTL,匀浆后加入100ulBuffer GTL。

二、血液及细胞:(1)如果提取材料为哺乳动物抗凝血液(无核红细胞),可直接向50-200ul新鲜或冷冻的样品中加入Buffer GTL 补足至200ul;

(2)如果为禽类、鸟类、两栖类或更低级生物的抗凝血液,其红细胞为有核细胞,取5-10ul新鲜或冷冻的样品,Buffer GTL 补足至200ul;

(3)贴壁培养的细胞应先处理为细胞悬液(最大提取量为5×106个细胞),12000rpm离心5min,弃尽上清,加200ulGTL,震荡至样品彻底悬浮;

三、细菌:a、革兰氏阴性菌

(1)取细菌培养物1-5ml(106-108个细胞,最多不超过2×109个细胞)置于离心管中,12000rpm离心1min,尽量吸尽上清。

(2)向沉淀中加入180ul Buffer GTL,震荡使菌体重悬。

(3)加入20ul Proteinase K ,涡旋混匀,56℃孵育,直至菌体完全裂解,孵育过程中每隔一段时间颠倒或震荡使离心管使样本分散。

注意:若需除去RNA,可在上述步骤后加入4ul浓度为100mg/ml的RNase A溶液,涡旋15s,室温放置2min。

加入200ul Buffer GL,涡旋震荡混匀。

b、革兰氏阳性菌

(1)取细菌培养物1-5ml(106-108个细胞,最多不超过2×109个细胞)置于离心管中,12000rpm离心1min,尽量吸尽上清。

(2)加入180ul Enzymatic Lysis Buffer,使菌体重悬。

(3)37℃孵育30min。

加入20ul Proteinase K ,涡旋混匀。加入200ul Buffer GL,涡旋震荡混匀。56℃孵育30min。

②RNA逆转录:同RT-PCR

③PCR:

操作体系

 RNase Free dH20                       9.5ul

          cDNA                          1ul

         上游引物                       1ul

         下游引物                       1ul

   2xULtraSYBR Mixture                12.5ul

反应程序,三步法:

   步骤                    温度                   时间

   预变性                  95℃                   3min

   变性                    95℃                   10s

   退火                    引物而定               30s

   延伸                    72℃                   30s

   融解曲线分析              

                           95℃                   15s

                           退火℃                 1min

                           95℃                   15s

                           退火℃                 15s

                           退火℃                 15s

                           95℃                   0.5℃

 

公司简介:

 

      深圳中洪博元生物技术有限公司是国内领先的生物医学领域整套科研服务供应商,是提供医学实验技术服务、整体实验外包一站式服务的生物医学类高科技企业

    公司内设细胞检测,蛋白检测,基因检测,组织学检测,病毒学服务,微生物服务,动物实验等专业实验室,进行相关领域的技术服务。公司在软、硬件投入上始终坚持高标准、高品质的要求,不断引进、消化、吸收国内外医学科研的先进技术,全力搭建一个优质的医学科研服务平台。公司科研团队具有丰富的科经验,在科学引文索引(SCI)杂志上发表数十篇文章。公司立足于生物医学领域,以客户需求为导向,建立了实验设计和评估、细胞检测,蛋白检测,基因检测,组织学检测,病毒学服务,微生物服务,动物实验、整体课题外包服务等平台,为客户提供最佳的实验设计服务和专业的实验解决方案,帮助客户缩短科研周期、节省试验成本,使客户的科学研究具有持续性。

    公司的核心研发团队已经研制出涵盖分子诊断和免疫检测等领域的200多种产品,具体包括临床/科研类荧光定量PCR试剂盒、Elisa检测试剂盒、转基因鉴定系列检测试剂盒等产品。并已经在全国包括北京、上海、广州、成都、杭州、南京、西安、重庆、兰州、郑州、南昌、合肥、武汉、长沙、福州等十多个城市形成分销网络。

   公司拥有一流的专业技术人员和雄厚的技术力量,公司现拥有数十位博士、硕士及海归人员,同时拥有多位具有高级职称的专业技术人员。公司目前已与近300余家医疗单位签约合作,分布于全国各地。同时也与多家医学院校展开合作,并得到相关医学院校的好评, 现已成为数所大学院校的实习与就业基地

 

 

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