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中洪博元生物 MTT分析法

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品牌: 中洪博元生物
型号: 0018
规格: 1
单价: 面议
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所在地: 广东 深圳市
有效期至: 长期有效
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公司基本资料信息
 
 
产品详细说明

 简介: MTT分析法

提供商: 中洪博元

服务名称: MTT分析法

地区: 全国

 

原理:

   活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物(formazan),并沉淀在细胞中,而死细胞没有这种功能。二甲亚砜(DMSO)能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物,溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值。

 

实验材料:

   细胞样品

 

试剂、试剂盒:

   PBS  DMSO 胰蛋白酶 甘氨酸缓冲液

 

仪器、耗材:

   加样器 96孔培养板 酶联免疫检测仪 培养板

 

具体操作:

普通MTT法

1、接种细胞:用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板,每孔体积200ul。

2、培养细胞:同一般培养条件,培养3-5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。

3、呈色:培养3-5天后,每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配制,pH=7.4)20ul.继续孵育4 h,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO,脱色摇床振荡10min,使结晶物充分融解。

4、比色:选择490nm(570nm)波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

药物MTT法

贴壁细胞:

1、收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度 1000- 10000 孔,(边缘孔用无菌PBS填充)。

2、5%CO2,37℃孵育,至细胞贴壁,加入浓度梯度的药物,原则上,细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,一般是前一天下午铺板,次日上午加药。一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个,否则难以反应真实情况。

3、5%CO2,37℃孵育24-72小时,倒置显微镜下观察。

4、每孔加入20ul MTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4h。若药物与MTT能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再加入含MTT的培养液。

5、终止培养,小心吸去孔内培养液。

6、每孔加入150ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm(570nm)处测量各孔的吸光值。

7、同时设置调零孔即空白组(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。

悬浮细胞:

1、收集对数期细胞,调节细胞悬液浓度1×106/ml,按次序将①补足的1640(无血清)培养基40ul ;②加Actinomycin D(有毒性)10ul用培养液稀释 (储存液100mg/ml,需预试寻找最佳稀释度,1:10-1:20);③需检测物10ul;④细胞悬液50ul(即5×104cell/孔),共100ul加入到96孔板(边缘孔用无菌水填充)。每板设对照(加100ml 1640)。

2、置37℃,5%CO2孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。

3、每孔加入10 ul MTT溶液(5 mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4 h。(悬浮细胞推荐使用WST-1,培养4 h后可跳过步骤4),直接酶联免疫检测仪OD570nm(630nm校准)测量各孔的吸光值)

离心(1000转x10min),小心吸掉上清,每孔加入100 ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm(630nm校准)测量各孔的吸光值。

同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜),每组设定3复孔。

 

注意事项:

1、选择适当得细胞接种浓度。

2、避免血清干扰:一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。

3、设空白对照:与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致,最后比色以空白调零。

4、MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间,超出这个范围就不是直线关系,IC50是半抑制率,意思是抑制率50%的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度,然后计算各自的抑制率,以药品的浓度为横坐标,抑制率为纵坐标作图,然后得到50%抑制率时候的药品浓度,就是IC50。要点:药品2倍稀释,多做梯度,做点线图即可!

5、吹打时悬液总量不能太多,达到吸管吸液量的3-4倍,可能比较容易混匀。10 ml的离心管里面最好装3-4 ml的悬液:悬液太少容易吹起很多气泡,悬液太多又不容易吹成单细胞悬液。

6、吸管的吸液量最好在1 ml左右:吸液量过多,一下吸起很多液体,管中所剩就很少,这样吹打容易起泡,吸液量过少,吹打的力度就不够,吹打就会不均匀。如果是吸液量1 ml多的吸管,总液量在5 ml左右为益。

7、吸的时候要在悬液底部,然后提起来一点,但是吹下去的时候不要离开液面,否则容易吹打出气泡。

8、吹打次数100左右,就可以吹打均匀了。

9、向每孔中用枪头加入细胞时不要太快,否则会使细胞聚积在底部。

 

 

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