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funakoshi UltraRIPA 脂筏提取缓冲液套装 UltraRIPA kit for Lipid Raft

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品牌: funakoshi
型号: F015
规格: 1kit
单价: 面议
发货期限: 自买家付款之日起 3 天内发货
所在地: 广东 广州市
有效期至: 长期有效
浏览次数: 3
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公司基本资料信息
 
 
产品详细说明

 UltraRIPA kit for Lipid Raft

大幅度提升膜蛋白提取效率的新一代RIPA缓冲液


与常规的非变性细胞裂解缓冲液(RIPA buffer, 1% Triton X-100等)相比,这款缓冲液套装(Buffer Kit)能迅速且高效地提取增溶相对困难的脂筏(Lipid Raft)蛋白质。从常规缓冲液中不可溶而丢弃的膜组分中,在维持蛋白质功能的情况下能实现高效地提取,有利于对脂筏等蛋白质的功能分析。

※本产品仅限于研究用。不可用于临床治疗。

 

◆细胞膜的可溶化和脂筏(Lipid Raft)

裂解细胞进行蛋白质功能分析的时候,经常会使用RIPA (Radio-ImmunoPrecipitation Assay)缓冲液和1% Triton X-100缓冲液等的相对温和的细胞膜裂解缓冲液。这些缓冲液对蛋白质的构造和功能的影响小,适用于酶活性试验、免疫沉降和各种结合实验等蛋白质的功能分 析。另一方面,与具有很强的蛋白质变性作用的SDS缓冲液相比,增溶能力较弱,完全不能溶解以脂筏(Lipid Raft)为主的细胞膜组分。许多表面活性剂都不能溶解脂筏,故其又被称为Detergent Resistant Membrane (DRM)。DRM中所含蛋白质的功能分析被认为是十分困难的。

 

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脂筏(Lipid Raft)是由胆固醇(cholesterol)和鞘磷脂(sphingomyelin),GPI锚定蛋白(GPI anchor protein)和棕榈酰化(palmitoylation)蛋白质组成的细胞膜构造,被认为是整合各种功能蛋白的功能域。神经细胞突触和免疫细胞的免疫 突触是脂筏的代表性例子。

 

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脂筏示意图



◆特点

  ● 操作简单,能快速提取脂筏蛋白

  ● 使用两种类型的缓冲液(A buffer,B buffer)进行两个阶段的提取。先提取出胞浆蛋白和非脂筏蛋白,然后提取脂筏蛋白

  ● Buffer提取的任何蛋白质都不会失活

  ● A buffer和一般的RIPA buffer成分相同*。B buffer含有表面活性剂,可以通过透析除去

  ● 适用于哺乳动物细胞/组织

  ● 使用本品配制的溶解液适用于酶活性试验、免疫沉淀(Immunoprecipitation)、蛋白定量(BCA法)、SDS-PAGE和Western blot等

  * 1% NP-40 Alternative,0.1% SDS,50 mMTris-HCl (pH8.0),150 mMNaCl,0.5% Sodium Deoxycholate

 


◆缓冲液套装组成

  ● A buffer (RIPA buffer) (100 ml)

  ● B buffer (10 ml)

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◆使用方法

1、用A buffer溶解组织或培养细胞。
※为了提高溶解效率,推荐使用均质或超声波破碎设备。

2、进行离心分离,使A buffer中可溶性组分(上层清液)和不溶性组分(沉淀)分离,分别回收。上层清液A buffer可溶性组分中主要含有胞浆蛋白和非脂筏蛋白。

3、往沉淀的A buffer 不溶性组分中加入B buffer,形成悬浊液。

4、进行离心分离,与步骤2一样分离出可溶性组分(上层清液)和不溶性组分(沉淀),分别回收。上层清液的B buffer可溶性组分中含有脂筏蛋白。

5、可应用于各种实验。

※A buffer和B buffer不可用于Bradford法蛋白质定量。蛋白质定量请使用BCA检测。

※使用本品A buffer和B buffer进行两个阶段的提取是最适宜的,也有只对细胞使用B buffer进行溶解和提取的例子。具体请参照以下例子。

 

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UltraRIPA kit 、1% SDS buffer和RIPA buffer的比较

 

蛋白分离

蛋白结构

蛋白功能

应用

胞质蛋白

膜蛋白

非脂筏蛋白

脂筏蛋白

>1%SDS buffer

SDS-PAGE

RIPA   buffer

酶分析法测定

免疫沉淀

SDS-PAGE等

UltraRIPA

 

 

◆应用例

从脂筏中提取总蛋白

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   用UltraRIPA kit A buffer溶解小鼠全脑组织后,回收A buffer不溶性组分(RIPA-insoluble fraction),添加2% SDS,RIPA buffer 和UltraRIPA kit B buffer进行提取。提取后的总蛋白用SDS-PAGE/银染色检测(左),用BCA法定量蛋白质(右)。相对于具有很强的蛋白质变性作用的2% SDS缓冲液,UltraRIPA kit能够提取70%以上的蛋白质。

  ※不能保证全部蛋白质的可溶性都得到改善。

 

脂筏标记蛋白的提取

   用UltraRIPA kit A buffer溶解小鼠全脑组织后,回收A buffer不溶性组分(RIPA-insoluble fraction),添加2% SDS,RIPA buffer 和UltraRIPA kit B buffer,提取后进行SDS-PAGE。利用对应脂筏标记蛋白的抗体进行Western blot检测。


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脂筏标记蛋白的免疫沉淀

用UltraRIPA kit A buffer溶解小鼠全脑组织后,回收A buffer不溶性组分,通过B buffer提取脂筏标记蛋白。对 buffer提取物使用脂筏标记蛋白PSD95的抗体和G蛋白偶联磁珠进行免疫沉淀。使用银染色和抗PSD95抗体通过Western blot检测进行确认。


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提取的蛋白质的酶活性测定

用1%TritonX100,RIPA buffer,UltraRIPA kit B buffer 和2%SDS溶解CHO细胞,测定溶解物中乳酸脱氢酶(LDH)的活性。2%SDS具有很强的蛋白质变性作用,在几乎完全失活的情况下,1% Triton X100,UltraRIPA kit A buffer,和UltraRIPA kit B buffer所得的酶活性大致相同。


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从脂筏中提取功能蛋白

用UltraRIPA kit A buffer溶解小鼠全脑组织后,回收A buffer不溶性组分。用A buffer分三次冲洗不溶性组分,消除RIPA可溶性组分中脱磷酸酶的活性。往不溶性组分中分别添加2% SDS buffer,A buffer(RIPA buffer)和B buffer,测定各种提取物的总脱磷酸化酶活性。下图是各缓冲液从RIPA不溶性组分中提取的蛋白质的量(左轴:黑)和所检测的脱磷酸酶的活性(右轴: 红)的示意图。2% SDS buffer能够从RIPA不溶性组分中很好地提取蛋白质,但容易导致蛋白质变性,完全失去脱磷酸化活性。RIPA buffer不能提取蛋白质,活性也无法检测。UltraRIPA kit B buffer所提取的蛋白质大约为2% SDS buffer的70%,且可以检测出较强的脱磷酸化活性。

 

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UltraRIPA kit B buffer单独提取脂筏蛋白的可能性评价

※数据提供:东京大学药学院研究生院保健化学系


用PBS冲洗COS-1细胞,分别使用SDS buffer,1% Triton X-100 buffer,UltraRIPA kit A buffer 和UltraRIPA kit B buffer裂解,通过离心分离(14,000 rpm, 5 min,4℃)可溶性组分和不可溶性组分。不可溶性组分用等量的SDS-PAGE样品缓冲液变性溶解。脂筏标记Flotilin1的可溶部分通过SDS- PAGE / western blot测定。使用1% Triton X-100和RIPA buffer,大部分的Flotilin 1不溶性膜组分没有被溶解,而UltraRIPA kit B buffer几乎可以全部溶解。


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◆各buffer组成

  ● SDS buffer (2%SDS, 1% Triton X-100, 50 mM HEPES・Na (pH 7.2), 150 mMNaCl)

  ● UltraRIPA kit A buffer (1% NP-40 Alternative,0.1% SDS,50 mMTris-HCl (pH8.0),150 mMNaCl,0.5% Sodium Deoxycholate)

  ● UltraRIPA kit B buffer (成分保密)

  ● 1% Triton X-100 (1% Triton X-100, 50 mM HEPES・Na (pH 7.2), 150 mMNaCl)
 

产品编号 产品名称 产品规格 产品等级 产品价格
F015 UltraRIPA kit for Lipid Raft 1kit
 

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